发酵抑制物

2024-06-10 版权声明 我要投稿

发酵抑制物(推荐2篇)

发酵抑制物 篇1

一、材料与方法

1. 实验用水。

本实验用水采用葡萄糖作为有机碳源, C∶N∶P为200∶5∶1, 并加入Fe、Co、Ni等细菌生长所必需的微量元素 (见表1) 。废水中的氨氮由NH4Cl (分析纯) 。

2. 试验装置。

本实验采用UASB装置。

3. 分析方法。

COD:重铬酸钾滴定法;pH值:玻璃电极法;SS和VSS:重量法;氨氮:分光光度法;产甲烷量:碱液吸收法, 吸收管内装有3%NaOH溶液, 用于吸收二氧化碳、硫化氢等酸性气体。

二、结果与讨论

1. 氨氮对厌氧消化的影响。

大多数化学物质在低浓度时对厌氧微生物活性有一定的刺激作用 (促进作用) , 而在高浓度时, 则产生抑制作用, 而且浓度愈高, 抑制作用愈强。COD为6000mg/L时氨氮浓度对厌氧颗粒污泥产甲烷活性的影响见图2。

1.进水箱;2.进水计量泵;3.UASB反应器;4.出水口;5.水封;6.湿式气体流量计;7.三项分离器;8.水浴;9.自动加热设备

由图2可以看出, 氨氮浓度为500mg/L和800mg/L时, 表现为对厌氧颗粒污泥产甲烷活性的促进作用, 二者的产甲烷能力分别比空白体系提高5%和9%;氨氮浓度提高到1500mg/L时, 对产甲烷菌产生抑制作用;当氨氮浓度为2500mg/L, 在反应初期即表现为抑制作用, 相应产甲烷活性的抑制程度分别为33%和50%;继续提高氨氮浓度, 产甲烷毒性更加强烈。实验中发现, 当氨氮浓度为800mg/L时, 累计产气量最大;反应开始阶段由于基质充足, 微生物代谢旺盛, 达到整个周期的最大产甲烷速率85mL/h (如图3所示) , 随着基质的降解, 产甲烷速率逐渐降低, 6h时, 产甲烷速率降至19.5mL/h, 反应比较平稳之后反应速率较低, 验证了反应器运行过程中停留时间选择6h的合理性。

2. 碱度和污泥浓度对产甲烷活性的影响。

厌氧微生物的生命活动、物质代谢与pH值有密切关系。pH值的变化直接影响着消化过程和消化产物, 不同的微生物要求不同的pH值。颗粒污泥利用不同底物时的生长适应pH范围不同。一般认为, 反应器内的pH值应保持为7.2~7.6。对于以碳水化合物为主的废水, 进水碱度与COD之比大于1∶3是必要的, 但对于含量较高有机氮和硫酸盐的废水, 碱度的控制方式有所不同, 不投或少投纯碱。适量惰性物如Ca2+、Mg2+和CO2-3、SO2-4等离子的存在, 能够促进颗粒污泥初成体的聚集和粘结。

分别进水在COD为8000mg/L、氨氮为800mg/L、Ph7.5和COD为8000mg/L、氨氮为2000mg/L、Ph5.9其他条件不变的情况下, 得到相应的甲烷累计产量如图4所示。由图4可以看出, 氨氮浓度相同时, 提供碱度的系统对氨氮的耐受力明显强于不提供碱度的系统。提供碱度系统的上清液pH值为7.5, 而不提供碱度系统的上清液pH值降至5.9, 系统受到较大的冲击。

三、结论

从产甲烷菌代谢机理、生理生化特征及其在厌氧消化中应用研究结果表明, 产甲烷菌在碳循环中具有独特的作用。它能够使污水中无法利用的碳源转化成甲烷, 既可生产清洁能源, 又可实现污水中污染物减量化。同时, 其代谢产物对病原菌和病虫卵还具有抑制和杀伤作用, 可以实现农业生产、生活污水的无害化。

1. 氨氮对厌氧颗粒污泥中的产甲烷菌存在正反两个方面的影响。氨氮浓度较低时, 对产甲烷菌起促进作用;而氨氮浓度较高时, 则表现为对产甲烷菌的抑制作用。当COD为6000mg/L时, 氨氮对颗粒污泥产甲烷菌产生抑制作用的浓度为1500mg/L, 最大产甲烷速率为85m L/h。

2. 随着基质的降解, 产甲烷速率逐渐降低。6h时产甲烷速率降至19.5m L/h, 之后反应速率较低。

发酵抑制物 篇2

关键词:克雷伯氏肺炎杆菌,1,3-丙二醇,乳酸,抑制

0 引言

1,3-丙二醇(1,3-PD)作为一种重要的化工原料,具有广泛的商业应用前景,因而生产工艺也备受关注。生产1,3-PD的途径主要有化学合成法和生物发酵法,生物发酵法生产1,3-PD因为其成本低、污染少、周期短、条件温和、操作性强而越来越得到大家认可[1]。

目前,以甘油为底物生产1,3-PD的菌株主要有:克雷伯氏菌、柠檬酸杆菌、乳酸杆菌和丁酸梭菌、巴斯德梭菌等。其中克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)因为生产1,3-PD过程中底物耐受力强、产物得率高、生产强度大,因而研究最为广泛[2]。特别是近年来,因生物柴油发展,甘油价格下降,通过克雷伯氏菌转化生产1,3-PD越来越引起关注[3]。

以甘油为底物发酵生产1,3-PD过程中,会产生种类繁多的代谢产物,除了1,3-PD外,还包括乙酸、乳酸、甲酸、琥珀酸和2,3-丁二醇(2,3-BD)等。乳酸作为主要的副产物之一,其抑制作用的研究也引起关注,乳酸一方面可以通过消耗还原性NADPH降低主要产物1,3-PD的生成,同时其产生也对菌体生长有抑制作用[4]。据报道,以产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)进行摇瓶发酵时,3.0g/L的乳酸对菌株生长起到了有效抑制作用,15.0g/L的乳酸浓度能够完全抑制菌株生长[5];然而也有报道,以K.pneumoniae进行厌氧摇瓶发酵时,乳酸浓度高达10.0g/L时对菌体生长仍无显著影响[6],后期乳酸的浓度甚至可以积累到40.0g/L[7],等等。因而有必要深入考察乳酸对1,3-PD发酵过程的影响。

深入了解主要副产物乳酸对发酵过程的抑制作用,有利于更好地控制发酵过程,以及开发废水回用的发酵工艺。本文考察了发酵过程中乳酸的抑制作用,发现了乳酸的抑制作用主要表现在前期,并探讨了其抑制作用可能的机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

克雷伯氏肺炎杆菌(K.pneumoniae)KG1,作者实验室选育。△ldh(敲除乳酸合成途径)、△bud AB(敲除2,3-BD合成途径)和△bud AB△ldh(同时敲除2,3-BD和乳酸合成途径)菌株为通过λRed同源重组方法构建,依次标记为KG1-1、KG1-3、KG1-5。

1.1.2 培养基

种子培养基(g/L):K2HPO4·3H2O 7.5,KH2PO42.5,NH4Cl 1.0,MgSO4·7H2O 0.2,酵母膏6.5,微量元素0.4 ml,p H调为6.8;

发酵培养基(g/L):Na H2PO4·2H2O 1.4,KCl 0.7,NH4Cl5.4,Na2SO40.3,MgCl2·6H2O 0.3,酵母粉2.6,柠檬酸0.5,微量元素各0.3 m L,p H 7.0;

微量元素的配比(g/L):Fe Cl3·6H2O 2.7,Zn Cl234.2,MnCl2·4H2O 8.0,Co Cl2·6H2O 23.8,Cu Cl2·2H2O 0.9,H3BO30.3,Na2MoO4·2H2O 0.3;

1.2 方法

1.2.1 培养方法

采用厌氧培养的方法来进行种子培养,250mL摇瓶,50.0mL装液量,37℃培养温度,摇床转速220r/min,培养12h。用5L全自动发酵罐(上海国强)进行发酵试验,2.0L装液量,接种量为5%,控制初始甘油浓度为40.0g/L,发酵温度控制为37℃。用Na OH控制p H值在6.8,发酵过程中补加甘油来控制发酵液中的甘油浓度,发酵周期为24h。

1.2.2 分析方法

菌体浓度测定采用分光光度比色法测定(OD650 nm),采用气相色谱(GC)法测定发酵液中的醇类代谢产物的含量,该气象色谱型号为GC112A,色谱柱为AT SE-54(30cm×0.53mm×1.0μ)毛细管柱,色谱工作站采用的是杭州普惠科学仪器有限公司生产的Sepu 3000,采用氮气作为载气,FID氢火焰检测器,柱温设定为120℃,进样器和检测器的温度分别设定为250℃和270℃。

采用高效液相色谱(HPLC)测定发酵液中的乳酸的含量,色谱柱型号为PLATISIL ODS 5μcolumn[250×4.6mm](DIK-MA,China),以0.005 mol/L H2SO4为流动相,流速为1.0 m L/min,柱温65℃。

2 结果与分析

2.1 添加乳酸对菌体生长和1,3-PD发酵的影响

在摇瓶条件下考察了乳酸对菌体KG1生长的影响,实验结果如图1所示,乳酸添加对菌体生长有明显的抑制作用。

添加6.0g/L乳酸时,培养10h后菌体生长抑制了37%,当添加乳酸浓度高达12.0g/L时,经过10h摇瓶培养,菌体生长近乎完全被抑制,和不添加相比,菌体生长降低了80%左右。

进一步在5L发酵罐中考察了前期添加6.0g/L乳酸对菌株活性以及产物合成的影响,采用菌株为KG1,发酵结果如图2所示。

从发酵过程中乳酸的变化和菌体的生长可以看出:副产物乳酸的积累主要是在发酵的后期,前期一般不积累乳酸(10h之前)。从图2(a)中可以看出,不添加乳酸发酵结束时副产物乳酸可以积累到5.0g/L左右。当发酵开始前添加6.0g/L后,发酵过程中乳酸的变化趋势和不添加组一样,但是发酵过程中乳酸的整体浓度普遍较高,发酵结束时,发酵过程中乳酸的浓度达到11.0g/L上下。添加乳酸组的菌株生长表现出明显的抑制作用,前期生长变慢,到达最高菌浓的时间推后,而且最高菌浓也较低,达到最高菌浓的时间推后了4h,最高菌浓降低了12%。图2(b)添加乳酸对发酵过程中的产物1,3-PD和另一主要副产物2,3-BD也表现出明显的抑制作用,发酵结束时1,3-PD和2,3-BD分别降低了19%和31%。

2.2 后期添加乳酸不表现出抑制作用

前面结果表明,添加乳酸对菌体生长和1,3-PD表现出明显的抑制作用,特别是表现出菌体前期的生长变慢,而发酵过程中副产物乳酸的积累主要是在发酵的中后期(10h以后)。实验进一步考察了后期副产物乳酸积累对前期添加乳酸抑制的贡献,比较了添加6.0g/L乳酸对KG1和KG1-1菌株菌体生长和产物生成的影响(图3)。

发酵后期乳酸浓度和KG1相比,没有增加,相反地还表现出来下降的趋势(图3a),比较两个菌株的菌体生长情况发现,虽然KG1-1的发酵过程后期的乳酸浓度显著降低,但是菌体生长情况并没有改善,与添加6.0g/L乳酸后KG1的生长情况几乎相同。比较两个菌株的产物1,3-PD和主要副产物2,3-BD的情况也可以看出,后期乳酸的下降对产物的形成也没有提高作用。

由于在KG1-1中后期乳酸显著降低,但是前期添加乳酸的抑制作用并没有消除,因此乳酸的抑制作用有可能主要发生在1,3-PD发酵的前期,为了证实上述推论,考察了发酵后期添加乳酸对菌体生长和产物形成的影响。发酵10h后,添加6.0g/L的乳酸,发酵结果如图4所示。

实心点为对照组,空心点为接种前添加6.0g/L乳酸。

Solid points represent the control groups,empty points represent adding 6.0g/L lactic acid before inoculation

实心点为KG1,空心点为KG1-1。

Solid points represent KG1,empty points represent KG1-1.

从图4中可以发现,添加6.0 g/L乳酸后,发酵后期乳酸浓度显著提高,发酵结束时乳酸浓度积累到11.0g/L,几乎和发酵开始添加乳酸的实验组一样(图2),但是发酵后期添加

2,3-BD是1,3-PD合成过程中最主要的副产物,正常情况下,发酵液中2,3-BD约占1,3-PD浓度的1/4左右,敲除KG1菌株中的bud A和bud B基因可以构建无副产物2,3-BD生产株KG1-3。实验发现KG1-3菌株,2,3-BD副产物虽然没有积累,但是菌体生长和1,3-PD的生产情况都收到了很大的抑制(图5),和KG1相比,发酵结束时,菌浓降低了18%,1,3-PD的产量降低了60%。为了分析KG1-3菌株降低的原因,进一步分析了其副产物乳酸形成的变化,结果如图乳酸菌体生长和产物1,3-PD(包括副产物2,3-BD)的形成几乎不受影响,因而后期添加乳酸不表现出抑制作用。

2.3 降低前期乳酸提高△bud AB菌株1,3-PD的生产水平5(a)所示。KG1-3乳酸合成浓度增加显著,增幅非常大(由5. 0 g/L的终浓度增加到19.5g/L),并且合成时间与KG1相比明显提前(发酵10h已经达到4.0g/L)。

菌株敲除2,3-BD合成途径后,乳酸的积累增加显著,并且积累时间提前,导致前期乳酸积累,因而有可能是导致了1,3-PD的终浓度降低的一个原因。于是在KG1-3的基础上敲除了乳酸合成途径,构建了乳酸与2,3-BD的双缺陷菌株KG1-5,发酵结果如图6所示。

Fig.4 Compare of adding lactic acid at the late stage

Solid points represent the control groups,empty points represent adding 6.0g/L lactic acid after 10h later in fermentation process.

实心点为KG1,空心点为KG1-3。

Solid points represent KG1,empty points represent KG1-3.

可以看到,KG1-5菌株乳酸的浓度接近于零,与KG1-3相比,菌浓前期增加明显变快,最高菌浓有8.2(OD650),增加了27%,最终菌浓也有7.1(OD650),提高了10%,1,3-PD终浓度由22.5g/L提高到35.1g/L,增加了56%。这说明了乳酸的前期降低促进了KG1-5的生长,这从一个侧面印证了前期乳酸对菌株生长和1,3-PD生成的抑制作用。

3 讨论

乳酸是K.pneumoniae合成1,3-PD过程中的重要代谢副产物,它的生成不但会和1,3-PD争夺还原当量(NADH),而且过高的浓度也会抑制菌体的生长[4]。然而目前有关乳酸抑制浓度的报道多种多样,高低相差近10倍。本文在摇瓶和反应器水平上仔细考察了乳酸对克雷伯氏肺炎杆菌生长和1,3-PD产生的影响,发现添加乳酸确实对菌体生长和产物合成有明显的抑制作用,添加6.0g/L时,最高菌浓降低12%,达到最高菌浓的时间推后了4h左右,1,3-PD的发酵终浓度由55.8g/L降低到45.0g/L,降低了19%。

仔细分析乳酸的抑制作用后发现,乳酸的抑制主要作用在1,3-PD发酵的前期,当发酵10h后添加6.0g/L的乳酸几乎不表现出抑制作用。分析1,3-PD的代谢过程发现K.pneumoniae生产1,3-PD的代谢过程中乳酸的积累主要是在10h之后,经过24h发酵,菌株会最终合成大约5.0g/L乳酸。从敲除乳酸菌株KG1-1的乳酸添加试验发现,发酵中后期菌体还会消耗发酵过程中的乳酸,这是否意味着,发酵后期菌体不但合成乳酸的能力增强,分解乳酸的能力也增强,因而表现出对乳酸的适应性与耐受性。所以许多文献也报道了K.pneumoniae在1,3-PD发酵后期乳酸可以积累到很高的浓度。从本文的结果也反应出,即使发酵中后期菌体能适应并耐受乳酸,然而前期乳酸的抑制作用都是不可逆的。

实心点为KG1-3,空心点为KG1-5。

Solid points represent KG1-3,empty points represent KG1-5.

2,3-BD是合成1,3-PD过程中最主要的副产物,当我们阻断了2,3-BD的合成途径后,乳酸合成时间提前,浓度升高,10h已经达到4.0g/L。乳酸和2,3-BD是克雷伯氏肺炎杆菌1,3-PD发酵丙酮酸支路的两个副产物,有报道敲除乳酸后会提高2,3-BD的合成[8],我们这里发现敲除2,3-BD后乳酸合成显著增加的现象。实验发现敲除2,3-BD代谢途径后,虽然副产物2,3-BD不积累,但是KG1-3的菌体生长和1,3-PD合成明显降低。考虑到可能的原因是乳酸提前积累导致的抑制作用,进一步在KG1-3的基础上构建2,3-BD和乳酸双缺陷的菌株KG1-5,KG1-5的发酵结果表明,菌体生长性能和1,3-PD的生产都得到了一定的恢复,相对于KG1-3,1,3-PD的产量提高了56%。

参考文献

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