PCR实验常见问题（推荐8篇）
作者: gene121(站内联系TA)发布: 2005-07-04 PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。一.假阴性，不出现扩增条带
PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及活性 ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不 够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。
靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。1假阳性
出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。
靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或 器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。③必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。2出现非特异性扩增带
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：①必要时重新设计引物。②减低酶量或调换另一来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。3出现片状拖带或涂抹带
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：①减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓度。④增加模板量，减少循环次数。二.PCR污染与对策
PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。污染原因
(一)标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。
(二)PCR试剂的污染:主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.(三)PCR扩增产物污染:这是PCR反应中最主要最常见的污染问题，因为PCR产物拷贝量 大(一般为1013拷贝/ml)，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物 污染，就可造成假阳就可形成假阳性。
还有一种容易忽视，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染;在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由 其造成的污染是一个值得特别重视的问题.(四)实验室中克隆质粒的污染:在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题也比较常见。因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力，其污染可能性也很大。污染的监测
一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。对照试验
1.阳性对照:在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照，它是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高(100个拷贝以下)，但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大。因而当某一PCR试剂经自己使用稳定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照。
2.阴性对照:每次PCR实验务必做阴性对照。它包括①标本对照:被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照。②试剂对照:在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增，以监测试剂是否污染。
3.重复性试验
4.选择不同区域的引物进行PCR扩增 防止污染的方法
(一)合理分隔实验室:将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其它步骤严格分开。最好能划分①标本处理区;②PCR反应液制备区;③PCR循环扩增区;④PCR产物鉴定区。其实验用品及吸样枪应专用，实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA或RNA。
(二)吸样枪:吸样枪污染是一个值得注意的问题。由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。
(三)预混和分装PCR试剂:所有的PCR试剂都应小量分装，如有可能，PCR反应液应预先配制好，然后小量分装，-20℃保存。以减少重复加样次数，避免污染机会。另外，PCR试剂，PCR反应液应与样品及PCR产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱。
(四)防止操作人员污染，使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用。(五)设立适当的阳性对照和阴性对照，阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标准病原体核酸为宜，并注意交叉污染的可能性，每次反应都应有一管不加模板的试剂对照及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照。
(六)减少PCR循环次数，只要PCR产物达到检测水平就适可而止。
关键词：荧光定量PCR技术,原理,主要类型,定量方法,优化
实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出,该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且具有灵敏度高、特异性和可靠性强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点[1]。目前,该技术已广泛应用于分子生物学、医学等学科和基础研究领域,特别是在现代农业转基因作物的定性检测、品系鉴定、转基因成分含量的检测中发挥着重要作用[2]。
1 荧光定量PCR技术的原理
荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法[3]。由于常规PCR无法对扩增反应进行实时检测,需借助凝胶电泳等手段对扩增终产物进行定性和半定量分析,不仅费时、费事、易污染,且无法对起始模板准确定量。荧光定量PCR技术是在反应体系中加入荧光基团,荧光基团发出的荧光信号随着反应进程而变化,每经过一个PCR循环反应,定量PCR仪收集1个荧光强度信号,通过荧光强度变化检测产物量的变化,从而得到1条荧光扩增曲线,荧光扩增曲线一般由基线、指数扩增期和平台期组成[4]。只有在荧光信号指数扩增阶段,PCR产物荧光信号的对数值与起始模板量之间存在线性对应关系,才可以在这个阶段进行定量分析。为了便于对所检测样本进行比较,在荧光定量PCR反应的指数期,需要设定1个荧光信号的阈值(threshold)。荧光阈值是荧光扩增曲线上人为设定的一个值,荧光阈值的缺省设置是3~15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍,用它可以定义样本的循环阈值(Cycle Threshold,Ct)。Ct值是PCR扩增过程中,反应管的荧光信号达到设定阈值时的循环次数。可见,Ct值取决于阈值。经数学证明[5],每个模板起始拷贝数的对数与Ct值存在线性关系。起始拷贝数越多,Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数[6]。
2 荧光定量PCR技术的主要类型
荧光定量PCR所使用的荧光化学材料可分为两大类,即荧光染料和荧光探针。荧光染料以SYBR GreenⅠ为主要代表,是非特异性荧光化学材料。荧光探针包括Taq Man、分子信标、荧光标记引物、杂交探针等,属于特异性荧光材料。
2.1 SYBR GreenⅠ
SYBR GreenⅠ是一种能够与双链DNA小沟结合的染料。在游离状态下,SYBR GreenⅠ发出微弱的荧光,但是一旦与双链DNA结合,其荧光强度大大增强。因此,一个反应发出的全部荧光信号与出现的双链DNA量成正比,可以根据荧光信号检测出PCR体系中的双链DNA的数量[7]。其优点是检测方法简单,通用性好,价格相对较低,是许多实验室开展荧光定量实验的首选。SYBR GreenⅠ的缺点在于它能够和所有的双链DNA相结合,因此由引物二聚体、单链二级结构、非特异性扩增产物引起的荧光信号会影响定量的准确性。但可以通过优化PCR的反应条件、选择设计良好的引物,来减少或去除引物二聚体和非特异性产物的产生;另外,也可以通过对扩增产物的溶解曲线进行分析来判断荧光信号的真实性。
2.2 Taq Man探针
Taq Man探针技术是有美国Perkin Elmer(PE)公司研制的一种实时PCR定量技术,在PCR扩增加入一对引物的同时加入1个特异性的荧光探针,此荧光探针为一个30~45 bp的寡核苷酸,它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对,其5′端标记荧光发射基团,3′端标记荧光淬灭基团。当探针保持完整时,3′端淬灭基团抑制了5′端发射基团的荧光发射。但在PCR扩增中,模板变性后低温退火,引物与探针同时与模板结合,在引物的介导下,沿模板向前延伸至探针结合处,发生链的置换,Taq DNA聚合酶的5′→3′外切酶活性将探针5′端连接的荧光发射基团从探针上切割下来,游离于反应体系中,从而脱离3'端荧光淬灭基团的屏蔽,接受光刺激发出荧光信号。由于被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是相对应关系,且荧光强度同被释放的荧光基团的数目也是正比关系,因此该技术可对模板进行准确定量[8]。Taq Man探针技术特异性好、准确性高、假阳性低、重复性比较好。但是需要设计特异性的探针,因此成本较高[9]。
2.3 分子信标
分子信标技术是一种呈发夹结构的茎环状双标记寡核苷酸探针,环部与靶DNA序列互补,为15~35 bp;茎部是由互相配对的碱基组成,但与靶DNA无序列同源性,约8 bp。在探针的5′端和3′端分别标记荧光发射基团和荧光淬灭基团。当溶液中的模板与分子信标结合配对时,分子信标的构象改变成链状使得荧光发射基团与淬灭基团分开,当荧光基团被激发时,就发出荧光信号。与探针互补的靶分子数量越多,荧光信号也就越强,从而实现了对目的基因的定量检测。分子信标的方法优点是特异性强,荧光背景低。其缺点是设计困难,杂交探针不能完全与模板结合,稳定性较差,价格高[10]。
3 荧光定量PCR技术的定量方法
实时荧光定量PCR技术是DNA定量技术的一次飞跃。运用该技术,可以对DNA、RNA样品进行定量和定性分析。定量方法包括绝对定量和相对定量。前者可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度;后者可以对不同方式处理的2个样本中的基因表达水平进行比较。
3.1 标准曲线法的绝对定量法
用一系列已知浓度的标准品,作为模板进行PCR反应,以标准品浓度的对数值为横坐标,以测得的Ct值为纵坐标,绘制标准曲线,在相同条件下检测未知样品的Ct值,从而根据标准曲线计算出未知样品的浓度(拷贝数)。制作1个好的标准曲线对定量结果至关重要,在制作标准曲线时,应至少选择5个稀释度的标准品,涵盖待测样本中目的基因量可能出现的全部浓度范围,最好与目的基因有较高的同源性;绝对定量标准品通常可以是纯化的质粒ds DNA,体外转录的RNA,或者是体外合成的ss DNA、标准品的量可根据260 nm的吸光度值并用DNA或RNA的分子量转换成其拷贝数来确定。
3.2 双标准曲线法的相对定量法
在某些不需要对基因进行绝对定量、只需要确定基因相对表达差异的情况下,如某基因在经过某种处理后表达量是增加了还是减少了,用相对定量的方法就可以得到结果。双标准曲线法是指在测定目的基因的同时测定某一内源性管家基因,并用目的基因和管家基因的标准品分别作出标准曲线,处理与未处理样品同时扩增目的基因和管家基因,获得Ct值,然后从各自的标准曲线上求出初始模板量,经管家基因均一化处理后,求出目的基因的相对含量。定量的表达是相对于某个参照物的量而言的,因此相对定量的标准曲线就比较容易制备,对所用的标准品不需要知道绝对拷贝数,只要知道其相对稀释度即可。通常选用的管家基因有GAPDH、β-actin、β2-微球蛋白和r RNA。此方法在扩增效率较低、目标基因与管家基因扩增效率有差异时适用,且需要很精确的结果计算。
3.3 比较Ct法的相对定量法
如果反应条件控制较好,扩增效率较高,目的基因和管家基因的扩增效率基本一致,这时就不需要作标准曲线,而是通过与管家基因Ct值之间的相差来计算目的基因的表达差异。比较Ct法运用了数学公式来计算相对量,前提是假设每个循环增加1倍的产物量,根据数学推导得出:
目的基因的量=2-ΔΔCt
在该公式中,ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)实验组-(Ct目的基因-Ct管家基因)对照组。因此,2-ΔΔC t表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数,使用这一方法可以直接得到的目的基因相对于管家基因的定量,而不必制作标准曲线[11]。
4 荧光定量PCR技术实验条件的优化
定量PCR技术已经在生物学研究中得到了广泛的应用,技术也日臻完善,并且敏感度极高,特异性强;正因为敏感度高,很容易受其他因素的影响,因此要得到准确可靠的反应结果,必须根据不同的反应类型优化实验条件,如特异性探针及引物的设计、选择合适的Mg2+浓度、引物和探针浓度、循环数等,规范操作步骤,并仔细配制PCR反应体系。
4.1 引物及探针
一是设计要求。引物设计是实时定量PCR中最重要的一步,扩增片段长度根据技术的不同有所区别:SYBR green I技术要求扩增片段不大于500 bp,Taq Man探针技术要求扩增片段长度在50~150 bp。引物序列选取应在基因的保守区段并具有特异性,长度一般为18~24 bp,避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对,引物自身不能形成环状发卡结构,熔解温度Tm值在55~65℃,GC含量在40%~60%,上、下游引物之间的Tm值相差不要超过4℃。在Taqman探针的设计上要求绝对保守,长度为30~45 bp,Tm值在68~70℃,探针的5’端不能为G和避免多个碱基同时出现,探针应尽可能靠近上游引物。二是浓度。引物和探针的浓度也会影响反应的特异性,引物浓度太低会致使反应不完全,引物浓度太高会导致非特异性产物扩增。最佳的引物浓度一般在0.1~0.6μmo L/L,探针的浓度在0.05~0.30μmo L/L,可以在这个基础上再进一步优化,以达到引物探针整体的最佳浓度。三是稳定性。一般从生物技术公司定制引物是以干粉形式运输的,使用时最好用TE溶液溶解,使其最终浓度为100μmo L/L,-20℃保存。纯度高、标记效率高的探针不仅荧光值高,且保存时间可以长达1年以上。由于反复冻融易导致探针降解,在确认探针质量好的情况下,最好稀释成2μmo L/L(10×),作为工作浓度分装多支,避光保存。四是退火温度。退火温度一般设定比引物的Tm值低5℃。在理想状态下,退火温度足够低,以保证引物同目的序列有效退火;同时还要足够高,以减少非特异性结合。合理的退火温度一般为55~70℃。
4.2 模板质量与浓度
模板的质量会影响PCR扩增的效率。模板应在-20℃保存,避免反复冻融。用TE溶液溶解和稀释模板,这能大大延长保质期。模板浓度应根据Ct值选择,使Ct值位于15~30个循环比较合适,若Ct值大于30,则应提高的模板浓度;如果小于15,则应降低的模板浓度。
4.3 镁离子浓度
Mg2+是影响Taq酶活性的关键因素。Mg2+的浓度过高,会增加非特异性扩增,降低忠实性;Mg2+的浓度过低影响Taq酶发挥最佳活性。一般来说,对以DNA或c DNA为模板的PCR反应,应选择2~5 mmo L/L浓度的Mg2+。
4.4 循环数
一般的实时定量PCR反应只需25~30个循环便可获得满意的结果,但是对于那些极微量的待测样本而言,适当增加循环数可以提高反应的检出底限,建议循环数为40个,但是并非循环数增加的越多,其敏感性就会越高。实际上,当循环数增加到某一值时,敏感性便不再升高。
4.5 重复实验和阴性、阳性对照
定量实验,误差是不可避免的,设立重复实验,对数据进行统计处理,可以将误差降低到最小,因此定量实验的每个样本至少要重复3次以上。为了增加PCR扩增反应的可信度,在扩增的同时,需进行阴性、阳性对照反应。阴性反应中不加模板DNA,而以水或缓冲液代替,用于检验是否存在PCR污染。阳性对照则用于检验PCR试剂和实验操作上可能出现的问题。相对来说,仪器、PCR试剂、SYBR GreenⅠ染料是很稳定的,而操作和模板是薄弱环节,模板的加入量一定要准确,为确保实验数据的有效性,每个样品至少平行做3次重复。使用微量移液器时,如果不仔细,就会产生较大的用量误差甚至错误。在实验过程中应当避免室温下混合各种试剂,应在冰上进行,避免所配体系产生气泡,并且在一经混合后立即开始进行扩增。
5 结语
通过设计针对目的基因的特异性引物和探针,并优化反应体系和控制反应条件,可以成功地建立快速、灵敏、特异的荧光定量PCR检测方法,实现大样本同时检测,节省大量的时间和反应成本。随着基因科学技术的发展,荧光定量PCR技术将会深入和拓展,在现代农业中得到更广泛的应用。
参考文献
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1.实验室内必须保持安静、整洁，不得大声喧哗，不得在室内从事与实验无关的事宜。2.禁止与实验无关人员出入，实验室主要通道入口及功能区域应有特殊的标志。3.实验室各区域有各自专用的实验设备和器材，包括工作服、拖鞋、洁净鞋，一次性消耗品、办公用品等，各有明显的标志，绝对不能混用。4.严格遵守人员及物品按单向流动，不得交叉混流。
5.严格按照基因检测操作规程进行实验和使用仪器设备，定期检测、校准并做好记录工作。6.每次基因检测中应设立阴阳对照。
7.实验室工作人员必须严格按照PCR实验室操作程序进行，实验开始前必须做好室内及工作台的清洁消毒，离心管、吸头等一次性用品需高压灭菌处理。
8.工作结束后必须立即应用10％次氯酸钠溶液消毒实验室台面，并用紫外灯照射实验室。试验中使用过的吸头，离心管等应送到指定的地点进行处理。
9.每日工作开始前需开启风机及空调系统，在运行30分钟后，记录各压差表数，如压差低于设定值的20％需及时清洗过滤系统，并填写相关记录表。如风机系统出现故障时，该实验室应停止使用。
临床基因扩增实验室采用PCR技术用于临床基因诊断，由于PCR技术对所检测的核酸模板进行大量扩增，容易出现实验室污染导致临床检测标本假阳性结果；另外由于PCR技术要求高、影响因素多（特别是RNA标本），实验过程处理不当易导致核酸模板无扩增现象，导致临床标本假阴性结果。因此临床基因扩增检验实验室技术验收和规范化管理是PCR技术本身需要，也是在临床上顺利应用该技术前提。
（一）硬件准备--实验室基本建设
1、根据文件要求，临床基因扩增检验实验室原则上分为四个单独的工作区域：试剂贮存和准备区；标本制备区；扩增反应混合物配制和扩增区；扩增产物分析区，如使用全自动封闭分析仪器检测，此区域可不设。
2、各工作区域必须有明确的标记，避免不同工作区域内的设备、物品混用。
3、进入各工作区域必须严格按照单一流向进行，即试剂贮存和准备区→标本制备区→扩增反应混合物配制和扩增区→扩增产物分析区。
4、不同的工作区域使用不同的工作服（不同的颜色）。工作人员离开各工作区域时，不得将工作服带出。
5、工作区域仪器设备配置标准：
(1)试剂贮存和准备区 2～8℃和-15℃冰箱：混匀器；微量加样器（覆盖1～1000μl）；移动紫外灯（近工作台面）；消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心）；专用工作服和工作鞋；专用办公用品等。
(2)标本制备区 2～8℃冰箱，-20℃或-80℃冰箱；高速台式冷冻离心机；混匀器；水浴箱或加热模块；微量加样器（覆盖1～1000μl）；可移动紫外灯（近工作台面）；超净工作台，消耗品；一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心）；专用工作服和工作鞋；专用办公用品等。
(3)扩增反应混合物配制和扩增区核酸扩增仪；微量加样器（覆盖1～1000μl）；可移动 紫外灯（近工作台面）；消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心）；专用工作服和工作鞋；专用办公用品等。(4)扩增产物分析区视检测方法不同而定。基本仪器设备如下：微量加样器（覆盖1～200μl）；可移动紫外灯（近工作台面）；消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心）；专用工作服和工作鞋；专用办公用品等。
（二）软件建设--质量手册编写与实施、人才资源（上岗证培训与相关知识学习）
临床基因扩增检验实验室的质量手册编写质量手册是阐明临床基因扩增检验实验室的质量方针，并描述过其质量体系的文件。质量手册规定了质量体系的基本结构，是实施和保持质量体系应长期遵循的文件。临床基因扩增检验实验室质量手册编写应依照卫生部下发两个文件，并结合本实验室实际情况编写适合本实验室的切实可行的质量手册。质量手册的提纲应包括三部分：质量方针和宗旨；工作制度；标准操作文件（SOP）。
（1）质量方针和宗旨制定临床基因扩增检验实验室的质量管理目标和质量保证体系的结构体系和总方针。
（2）工作制度一般应包括以下文件：实验室的设置、布局及组织结构；实验室内务管理制度；实验室的人员配置及管理制度；生物的防护与安全制度；实验室废弃物处理制度；实验室清洁消毒制度；仪器设备的管理制度；仪器、试剂、耗材购置程序及管理制度；临床标本的管理制度；实验室记录的管理制度；质量控制工作管理制度；结果报告管理制度；抱怨的内部处理制度；负责人及质检员职责；岗位设置和责任制等......（3）标准操作程序（SOP）一般包括：消毒液配制标准操作程序：消毒标准操作程序；超净工作台使用标准操作程序；超净工作台维护和保养标准操作文件；PCR仪使用标准操作程序；PCR仪维护和保养标准操作程序；高速低温离心机使用标准操作程序；移液器使用标准操作程序；冰箱维护和保养标准操作程序；电热恒温水浴箱操作程序；电子天平使用和校正操作程序；可移动紫外消毒车使用操作程序；加样器校准标准操作程序；离心机维护保养操作程序；温度计校准程序；试剂的质检操作程序；标本唯一标识编号编制规则；临床标本的采集及处理操作程序；临床标本的保存程序；乙肝病毒核酸扩增荧光检测标准操作程序；丙肝病毒核酸扩增荧光检测标准操作程序；结核分枝杆菌核酸扩增荧光检测标准操作程序；沙眼衣原体核酸扩增荧光检测标准操作程序等。
一、按照规定，废弃物按要求存放，统一销毁。
二、为加强环境保护，防止有毒有害废弃物的流散而污染环境。根据我室具体情况，特制定本办法：
1、实验室医学废物的处理要严格遵守国家有关法律法规和标准，在设计和执行关于生物危害性废弃物处理、运输和废弃的规划之前，必须参考最新版的相关文件。
2、废弃物处理的首要原则是所有感染性材料必须清除污染、高压灭菌或焚烧。
3、本室明确专人负责实验室废弃物的登记、收集和处理，在各室配套污物收集桶。
废水：配有利器盒。
废物：废枪头、EP管等固体废物交吴山固废统一无害处理。
废气：经换风扇、通风柜排出室外，备有口罩、胶手套、防护镜眼等劳保用品，防止气溶胶的伤害。
4、应在每个工作台上放置盛放废弃物的利器盒。当使用消毒剂时，应使废弃物充分接触消毒剂(即不能有气泡阻隔)，并根据所使用消毒剂的不同保持适当接触时间。盛放废弃物的容器在重新使用前应高压灭菌并清洗。
5、培养基、组织、体液及其他具有潜在危险性的废弃物须放在防漏的容器储存、运输及经压力蒸汽灭菌处理后按医疗废物处理。
6、高压蒸汽灭菌是清除污染时的首选方法。需要清除污染并丢弃的物品应装在容器中。也可采用其他可以除去和(或)杀灭微生物的替代方法。
7、废弃物处理办法：
（1）实验废液排入实验室内工作区污水设施，由实验室内污水处理设施处理后排入市政管网。
（2）固体废弃物标本：
a、带有血凝块等的废弃样品管，在加盖后应当放入标有“医疗废物”黄色包装容器内，容量不能超过容器3/4，集中送入吴山固废进行无害化处理。
b、使用过的枪头、EP管、使用过的试剂瓶等放入10%的次氯酸钠的利器盒中浸泡4h以上，然后集中送入吴山固废进行无害化处理。
c、可反复利用的已被污染的材料应选择先消毒再高压灭菌或直接高压灭菌。灭菌后的材料经洗涤、干燥、包扎、再灭菌后使用。
实验注意事项：
（1）DNA处理最好用硅烷化塑料管以防粘附在管壁上，所有缓冲液吸头、离心管等用前必须高温高压处理，常规消耗用品用后作一次性处理，避免反复使用造成污染。
（2）PCR操作应戴手套并勤于更换，必要时应戴好帽子和口罩，就像做手术一样，要有“无菌观念”。
（3）成套试剂，小量分装，专一保存，防止它用。配制试剂用新器具，用后作一次性处理。（4）试剂管用前先瞬时离心（10s），使液体沉于管底，减少污染手套与加样器机会。（5）最后加模板DNA，马上盖好，混匀，瞬时离心（10s），使水相与有机相分开。加入模板且忌喷雾污染，所有非即用管都应盖严。加模板DNA后应更换手套。（6）实验设阳性、阴性对照。
还有诸如：移液枪用完要放到最大计量位置，防止久了弹簧失灵；防止RNA酶污染标本；低温下操作，防降解；试剂有致癌致畸作用，做好个人防护；头脑中各操作步骤要清楚，不要加错试剂。
问题及解决方案汇总：
一、假阴性，扩增无条带
PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及活性 ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不 够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。
靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
二、假阳性
出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。
靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或 器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。③必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR来减轻或消除。
三、出现非特异扩增带
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：①必要时重新设计引物。②减低酶量或调换另一来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。④适当提高退火温度或采用两步法。
四、出现片状拖带或涂抹带
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：①减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓度。④增加模板量，减少循环次数。
五、出现大量引物二聚体
1.从引物自身着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法； 2.可能模板有问题；
3.模板浓度过小，适当加大模板量；
4.Taq酶，引物，Mg2+浓度可能过高，可降低它们的浓度；
5.取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出置于冰上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引物二聚体就会消失的；
6.所配Mix中加5%的甘油或者5%的DMSO，可以增强特异性；
7.PCR反应体系的配制在冰上进行，最后加Taq酶，PCR结束后，产物勿放置在室温下过长时间，有人认为室温下有些Taq酶会将多余的引物合成为二聚体。
8.增加循环数；
9.降低退火温度后有条带，则应逐渐提高温度，若提高温度的同时产物量减少，则考虑增加镁离子浓度（根据扩增片断长度而定，片段长则相应镁离子浓度应该高一些）；
10.若降低退火温度，发现还是只有引物二聚体，而且镁离子的浓度在20-25mM没有区别，则考虑Buffer等试剂没有完全融解、混匀，导致吸取的试剂浓度不对。11.以上次的PCR产物作模板二次PCR，可以提高引物与模板的特异性，减少引物二聚体，如果两次时间间隔短的话，可以把原产物稀释100－1000倍，如果间隔较长可以稀释50－100倍；
六、高GC与复杂结构的模板处理
将模板置于95℃水浴锅中处理10分钟以上，然后置于冰上瞬时冷却，可大大降低二级结构对PCR的影响。
七、长片段与短片段拼接失败（定点突变）
在做定点突变时，倘若突变位点距离基因的某一侧较近（短片段<200bp）时，通常拼接困难或者难以通过电泳结果直观判断是否拼接成功。此时，可在短片段的上方（突变近5’端）或下方（突变近3’端）选取一条载体通用引物与基因另一条引物PCR（控制产物大小>300bp），然后再做基因拼接。确认大小无误后，再以此产物为模板，用基因首尾引物PCR即可。
八、Long PCR无条带
对于>5Kb片段扩增，常规PCR很难得到较好的条带，建议①更换更适合于Long PCR的聚合酶；②添加PCR Enhancer调整体系；③设计多对引物分段扩增。
PCR增强剂（PCR Enhancer）：
常见的添加剂有：DMSO，甘油，甲酰胺，硫酸铵，甜菜碱，BSA等，它们对PCR反应的影响虽然有所不同，但都可提高PCR的扩增效率。
1.DMSO：解除模板DNA局部二级结构，增加引物与模板的特异性结合，使聚合酶更容易在二级结构处延伸，但是对酶活有抑制作用，且当其浓度大于10％时还会降低保真性。
Nucleotides（核苷酸）and polymerases（聚合酶）, too.Denaturing（变性）, annealing（退火）, and extending（延伸）.Well it’s amazing what heating and cooling and heating will do.PCR, when you need to detect mutations（基因突变）.PCR, when you need to recombine（基因重组）.PCR, when you need to find out who the daddy is.PCR, when you need to solve a crime.中文歌词：
从前你要扩增DNA，总有培养大批细胞的重任要你背。
这时有个家伙叫Kary Mullis博士的，他钻出来说体外合成也一样OK！只要把你的模板混上缓冲液，再加些引物，还有核苷和聚合酶。变性，退火，和延伸。
加热~冷却~加热~太神奇了！当你想要检测突变，来啊做PCR吧！
当你想要基因重组，来啊做PCR吧！
摘要：PCR技术是一种体外酶促合成、扩增特定DNA片段的方法。因其高强的特异性和灵敏度以及检测速度快、准确性好等优点，该技术已经广泛地应用于水产、微生物检测、临床微生物、基因表达、肿瘤免疫、微小残留病变的检测，DNA拷贝数的测量、基因组变异和多态性等许多方面。本文主要介绍4种PCR技术及其在各个领域的应用现状。关键词：PCR技术；分类；研究现状；应用； Research and Application Status of PCR Technology Class 1 Bio-engineering 10
Student: Lao Yangyan
Student ID: 1031250019
Tutor: Wei Dongmei Abstract: PCR is an in vitro enzymatic synthesis，amplification of specific DNA fragment.Because of its high-strength specificity and sensitivity，detection speed and good accuracy，it has been widely applied in many fields such as the aquatic，microbial detection，clinical microbiology，gene expression，tumor immunology，detect ion of minimal residual lesion，measurement of DNA copy number，genome mutation，polymorphism and so on.This article summarize 4 kinds of PCR technology，with its application status is analysed.Keywords: PCR technology；Category；Progress research；Application 引言
聚合酶链反应(PCR)技术问世20多年以来, 已经在生物学研究领域内得到了巨大的发展并不断的完善, 不仅广泛应用在基础研究领域, 在疾病诊断等方面也有了越来越广泛深入的研究和应用。1985年，美国Karray等学者首创了PCR 技术，并且由美国Cetus 公司开发研制[1]。随着科学技术的发展和突破，PCR 技术已在多个领域得到广泛地应用，如微生物检测、兽医学、水产养殖等方面。由于该技术具有较强的灵敏度、准确度和特异性，又能快速进行检测，因而其应用领域也在不断延伸[2]。随着PCR 技术的不断发展，在常规PCR 技术的基础上又衍生出了许多技术，如多重PCR技术、实时荧光定量PCR技术、单分子PCR 技术、变性梯度凝胶电泳技术。目前应用最多的为荧光定量。本文主要介绍4种PCR技术及其在各个领域的应用现状。并对PCR的前景进行了展望，让其更好的服务于人们的生活。PCR技术原理
PCR 技术是根据待扩增的已知DNA片段序列、人工合成与该DNA 2条链末端互补的2段寡核苷酸引物，在体外将待检DNA序列（模板）在酶促作用下进行扩增。PCR 的整个技术过程经若干个循环组成，一个循环包括连续的3个步骤：第1步是高温条件下的DNA模板变性，即模板DNA在93~94℃的条件下变性解链；第2步是退火，即人工合成的2个寡核苷酸引物与模板DNA链3’端经降温至55℃退火；第3步是延伸，即在4种dNTP底物同时存在的情况下，借助TaqDNA聚合酶的作用，引物链将沿着5’-3’方向延伸与模板互补的新链[3]。经过这个循环后，合成了新链，可将其作为DNA模板继续反应，由此循环进行。循环进程中，扩增产物的量以指数方式增加，一般单一拷贝的基因循环25~30次，DNA可扩增l00 ~200万倍。PCR反应的步骤很简单，但是具体的操作是复杂的，如退火温度的确定、延伸时间的长短以及循环数等。因此，不同的反应体系应该确定适当的反应条件，以避免假阴性或假阳性等情况的产生。PCR技术的分类
在传统PCR 技术的基础上，根据人们的需要以及各个领域的应用要求，又衍生出很多种类的PCR 技术。新技术在各领域广泛应用并逐渐改进，为进一步的研究提供了基础。2.1 实时荧光定量PCR技术 1996 年，学者经过研究，在传统PCR 技术的基础上，首创了实时荧光定量PCR 技术，新技术已经应用至医学领域、分子生物学和其他基础研究领域。实时荧光定量PCR 技术基于传统技术的优势，还具有实时性、准确性、无污染，实现了自动化操作和多重反应，是PCR 技术研究史上从定性到定量的飞跃[4]。荧光定量PCR 技术最大的特点是能将荧光基团加入到PCR 反应体系中，借助于荧光信号，累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析[5]。实时监测这一特点是常规PCR 技术所不具有的，因为其对扩增反应不能进行随时的检测。常规PCR 技术的扩增终产物需要在凝胶电泳等条件下才能进行，无法对起始模板进行准确的定量，而荧光定量PCR 技术的反应进程可以根据荧光信号的变化做出准确的判断[6]。一个PCR 循环反应结束之后，定量PCR 仪可以收集1个荧光强度信号，荧光信号强度的变化可以反映产物量的变化情况，这样就可以得到1条荧光扩增曲线[7]。荧光信号在指数扩增阶段，PCR 产物荧光信号的对数值与起始模板量之间存在线性对应关系，然后进行定量分析[8]。2.2 多重PCR 技术 多重PCR（mutiplex PCR）技术是PCR 技术的一种，为同一管中加入多对特异性引物，与PCR 管内的多个模板反应，在一个PCR 管中同时检测多个目标DNA分子。多重PCR技术可以扩增一个物种的一个片段，也可以同时扩增多个物种的不同片段[9]。在同一反应体系中，多重PCR 技术进行多个位点的特异性扩增时，引物间的配对、引物间的竞争性扩增等会对扩增效果产生重要影响。一方面，如果能选择适宜的反应体系和反应条件，可极大地提高多重PCR 的扩增效果[10]。主要包括退火温度、退火及延伸时间、PCR 缓冲液成分、dNTP 的用量、引物及模板的量等。另一方面，DNA的抽提质量也影响多重PCR 扩增效率，如DNA抽提不干净或降解都将影响PCR 扩增效果[11]。2.3 单分子PCR 技术（SM-PCR）
单分子PCR 技术是在传统PCR 技术的基础上发展的，基本循环过程相同，但在反应条件、模板数量、DNA聚合酶选择、引物设计方面具有不同点。该技术是以少量或单个DNA分子为模板进行的PCR[12]。单分子PCR 技术反应中，DNA模板浓度极低，这就要求模板有较高的质量。因为这是试验成败的决定性因素。在设计引物时，应该严格控制GC 的含量和Tm值，同时尽量避免引物间存在可配对序列。在反应混合物模板数极低的情况下，若引物之间存在少量配对序列，扩增时极易形成二聚体，使反应无法进行，得不到所需要的产物[13]。由于单分子PCR 技术反应的变性温度（96~98 ℃）大多比常规PCR 技术（94 ℃）略高，因而对DNA聚合酶热稳定性的要求也更加严格，需要有较好的热稳定性，以防止温度过高而使其失活。其变性时间（5~15 s）、退火时间及延伸时间也短于常规PCR技术。2.4 变性梯度凝胶电泳PCR技术(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)PCR-DGGE 技术是基于核酸序列的不同，将片段大小相同的DNA序列分开的一种技术方法[14]。在进行变性梯度凝胶电泳时，序列不同的DNA片段因为碱基组成和排列的差异，在聚丙烯酰胺凝胶中解链时需要不同的变性剂浓度，并会发生空间构型的变化，最终导致电泳迁移率的差异。将通过PCR扩增之后得到的等长双链DNA分子，在含梯度变性剂(如尿素、甲酰胺)的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳时，电泳迁移率的差异会使不同序列的DNA片段停留在凝胶的不同位置，从而形成相互分开的条带图谱[15]。从理论上讲, 只要选择的电泳条件足够精细, 就可以分开仅有1个碱基差异的DNA片段[ 16]。PCR技术的应用
3.1 PCR技术在水产上的应用
基因表达是检测某个基因在不同发育期或不同组织中的表达量变化，或受到某种试验处理过程中的影响而出现表达量变化的情况。有学者应用real-time PCR 技术研究碳水化合物含量对翘嘴红鲴糖代谢酶G6Pase、GK 以及PEPCK表达量的影响[17]，研究结果可为翘嘴红鲴饲料配方中的最合适糖含量提供理论依据[18]。孙淑娜等研究叶酸拮抗剂对斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2表达的影响，表明叶酸拮抗剂对早期胚胎的心脏发育影响较大，可导致斑马鱼心脏发育延迟及心脏形态异常，并下调斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b 及HAS2 的表达，这可能是叶酸生物学活性受抑后导致心脏发育异常的机制之一。Sawyer et al以斑马鱼的未受精卵、胚胎、仔鱼和成鱼为研究材料，采用实时荧光定量PCR 技术，检测了P450aromA和P450aromB 在不同组织的表达量，表明在各组织中均有2种基因的表达，但表达量显著不同，呈现组织特异性。3.2 PCR技术在食品微生物检测中的应用
实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术实现了PCR 从定性到定量的飞跃，除了具有常规PCR的快速、灵敏、操作方便等特点外，还具有以下优点：全封闭反应，无需凝胶电泳等PCR后处理，减小对环境的污染；不使用有毒试剂，操作安全；定量准确；仪器在线实时监测，结果直观。
多重PCR技术是通过对普通PCR技术的改进而建立起来的一种技术，是将多条引物和多条模板混合在一个反应体系中分别特异扩增不同的目的条带，或者多条引物和单一的模板DNA混合在同一反应体系中扩增同一模板的不同片断，常用于对超长片断的扩增。与常规的PCR相比，还具有扩增效率高、产物特异性高和经济简便等特点，特别适合食品中多种致病菌的快速检测。
PCR-DGGE技术具有可检测不可培养类细菌、检测时间短、检测率高、重复性好等优点。近些年来，此技术在食品中检测微生物后应用也有报道。3.3 PCR技术在临床微生物中的应用
许多传染病的特点是具有高度的变异率，这会严重影响对致病菌的评估，分子信标可以用于病原菌的定量。它的优点是: 一个没有荧光的淬灭物可以用于4个不同的荧光染料，这样就可以同时检测和定量4个样本。在许多应用领域需要同时对多个核酸进行定量，这将大大降低检测的花费和所需的时间。这个方法的另一个好处在于加样的误差被最小化了，而且所有核酸都是在相同的条件下同时扩增，这样它所获得的数据就更加精确可靠。当然，多通道检测比单通道检测更为复杂也需要解决可能出现的更多问题。广东省花都市人民医院、中山医科大学基因诊断中心采用荧光定量PCR 检测技术对淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒等5个项目进行了定量测定，结果表明定量PCR方法可靠性和重复性好，且操作简便、快速，结果判断客观。除此以外，目前已有用此方法对人类免疫缺陷病毒，肝炎病毒，结核杆菌，巨细胞病毒，EB病毒，流感病毒A、B等病原体进行检测的报道。
3.4 PCR技术在畜牧兽医领域的应用
家育DNA多态性研究是近年来兴起的分子水平遗传标记选择技术, 对于开展品种问遗传差异程度、种群间亲缘关系、个体问遗传相似性, 亲子鉴定等方面的工作, 对于开展数量性状的间接选择, 早期选择, 提高数量性状选择效率等研究均具有重要的意义和潜在的应用价值。PCR技术的出现大大推动了上述研究的进程。以PCR技术为基础的DNA多态性分析和检测技术, 如PCR-RFLP(限制性长度多态性), PCR-SSCP(多聚酶链反应产物的单链构象多态性)和AFLP(扩增片断长度多态性)等, 已经在猪DNA多态性研究中得到了应用, 并且有可能迅速推广到育种实践中去。
3.5 PCR技术在转基因食品检测中的应用
转基因食品，是利用基因工程技术将有利的基因转移到微生物,，植物或动物细胞内，使他们获得有利的特性，再由这些转基因物种生产或处理获得的食品及添加剂。由此可增加食品的种类，提高产量，改进营养成分的构成，延长货架期等，目前，转基因作物及其产品的安全性问题越来越引起消费者的重视[25]。为了保护人类的健康，世界卫生组织在20世纪90年代提出了对转基因食品进行安全性评价的要求，对食品中的GMOs存在与否进行标示。因此，对食品中的GMOs 进行监测，建立安全性检验的技术与方法，成为管理和审批工作的重要基础。在众多的监测方法中，PCR 是最常用以及最适用的监测转基因食品的方法。PCR 方法中，常用的几个特定序列分为三类：
1、调控序列：他们调节转入植物的基因的表达。由于大多数转基因食品的基因都含有CaMV 35S 启动子和NOS 终止子，因此，在检测食品中是否含有GMOs 时，可以直接检测CaMV 35S 启动子和/或NOS 终止子的存在与否，如果存在，即可说明其中存在GMOs。
2、标记序列，用于帮助在遗传转化中筛选和鉴定转化的细胞，组织和再生植株，一般是抗生素抗性基因。
3、目的基因，即转入的基因，如抗虫、抗除草剂基因。用PCR 方法鉴定植株中检出的目的基因，标记基因，报告基因，35S，NOS 等外源基因片段，为转基因食品的筛选鉴定及为安全性评价提供敏感直接的数据，成为转基因食品安全性检验中一项重要的技术手段。PCR技术的应用前景展望
传统PCR技术以及衍生出来的新型PCR技术自面世以来，已被广泛应用到生命科学的各个领域。随着技术方法的不断改进与完善，荧光定量PCR技术将会逐渐完善并广泛应用；多重PCR技术在食品病原微生物、非致病微生物及环境微生物检测中将具有重要作用。未来的研究主要集中在去除食品抑制因子干扰、改进样品前处理技术等方面。
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